我们在前期添加细胞因子诱导人脐带间充质干细胞(HUMSCs)的条件下,后期转染肝细胞核因子4a(Hl}'F'4a)并检测诱导效果,寻找一种新的肝细胞种子来源.
          一、材料与方法
          1.材料:脐带由南京医科大学附属南京医院妇产科提供.
          2.真核表达载体的构建:设计可以扩增HNF4.全长的引物,上游引物为5’-AGGATCCATGCGACTCTCC.AAAACCC-TCG-3',下游引物为5'-AGAATTCCC'I'-AGATAACTTCCTGCTTGGTG-3’.
          3.HUMSCs的分离、培养:采用组织块培养法获取原代HUMSCs.细胞达80%左右融合时用0.25%胰酶消化,按1:3比例传代培养.
          4.HUMSCs向肝细胞方向分化诱导方法:用含10岁L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),20,留LHGF的IMDM诱导 9d,3--4d换液1次.然后采用阳离子脂质体法将质粒PCD\As.1}HVF4a转染到HI}l"C*中(实验组),对照组转染空质粒PCD \A3.1
          5.实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR):取末诱导、诱导9d、诱导21d实验组和对照组细胞,相关操作按说明书进行
          6.免疫荧光法:取诱导21d的实验组和对照组细胞,相关操作按说明书进行.
          7.统计学方法:结果以均数士标准差表示,应用SPSS16.0统计软件分析.
          二、结果 1.形态学改变:转染HNF4.后5d,细胞开始聚集成团,12d后细胞由梭形变为圆形或类圆形对照组细胞仍为纤维母细胞样.
          2.免疫荧光检测结果:结果发现实验组细胞白蛋白(ALB)表达显著,而甲胎蛋白(AFP)表达极弱.对照组细胞内ALB基本不表达,但是表达一定的AFP.
          3.肝细胞特异性基因的表达:结果显示添加细胞因子上调了基因ALB,酪氨酸氨基转移酶(TAT)及葡萄糖6-磷酸酶(G-6P)的 表达,对照组细胞继续培养12d后ALB,TAT、细胞色素P450酶3A4(CYP3A4)及G-6P表达量较前有所增高(P<0.05),而实 验组同等基因的表达量显著增高(P<0.O5).
          三、讨论 HNF4.是核激素受体超家族的一员,对于维持肝细胞表型、肝细胞分化以及肝细胞结构都发挥重要作用.本实验形态学结果显示,转染HNF4a的实验组与对 照组比较,细胞更具有肝细胞样特征,呈圆形、类圆形或多边形,转染12d后尤为明显免疫荧光结果发现,转染12d后,ALB作为肝细胞分化成熟的标志物, 在实验组细胞内有较强表达,而对照组红色荧光极弱.AFP作为肝细胞特异性标志,在幼稚肝细胞高表达,在成熟肝细胞低表达,两组细胞内,可见实验组AFP 荧光信号极弱.因此,可以认为HNF4.促进了干细胞诱导分化并获得了成熟的表型.RT-qPCR结果显示,尽管转染空质粒12d后(对照组)特异性基因 ALB,TAT,CYP3A4及G-6P的表达较前有所增高,但实验组与对照组的差异有统计学意义,表明HNF4.通过对基因的转录调控有效促进了 HLMSCs向肝细胞的分化.
          参考文献 
          Watt AJ,Ganison WD,Duncan SA. HNF4:a central regulator of hepatocyte differentiation and function[J].Hepatology,2003.1249-1253.
          Parviz F,Matullo C,Garrison WD. Hepatocyte nuclear factor 4alpha controls the development of a hepatic epithelium and liver morphogenesis[J].Nature Genetics,2003.292-296.