实时荧光定量

实时荧光定量pcr仪，由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。

5700将PCR热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况。PCR实验结束后可以马上得到定量结果，无需凝胶电泳分析，无需纯化PCR产物，无需进行任何实验操作。5700型实时荧光定量PCR系统采用96孔反应板或单个及8联管，反应体积25-100微升，实验可以在不到2小时内结束。与其他人工基因定量分析方法如Northern blotting or RNase-protection assays相比，5700型实时荧光定量PCR系统具有时间省，灵敏度高，准确性好和线性范围宽等优点。

1.可进行准确的定量检测，实时性和准确性好。

2.定量范围宽。

3.灵敏度高。

4.特异性和可靠性更强，克服了假阳性。

5.操作简单快速，无污染，无须后处理和电泳检测。

6.安全，技术易于学习，易于进行电脑化数据管理.

7.目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时荧光定量主要用于绝对定量、mRNA基因表达差异，单核苷酸多态性（SNP）基因分型检测，Non-coding RNA和microRNA分析，基因拷贝数（CNV）分析，DNA稀有突变分析，可检测占背景野生型细胞0.5%的微量突变细胞或DNA，基于荧光定量PCR仪的蛋白表达和蛋白相互作用分析等。

1、六个检测通道，可实现5重PCR，可同时检测5个靶基因，专用FRET检测通道。

2、有动态温度梯度PCR功能，可以同时运行8个不同的温度，每个温度孵育时间相同。

3、完全试剂开放，各种科研和临床试剂适用。

4、适用于多种荧光方法，如Taqman，Molecular Beacon，FRET探针，SYBR Green I等。

5、耗材开放，可使用0.2ml单管、八联管、96孔板等。

6、可独立运行，真正离线操作，无需连接电脑即可实时监控PCR荧光扩增曲线。

1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃（左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

1.在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA断裂。

2.为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

3.内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

4.PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。

5.防止DNA的污染：采用DNA酶处理RNA样品，在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。

6.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

7.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

8.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。