荧光定量pcr仪

荧光定量PCR检测仪，是指通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监测反应过程的仪器。结合相应的软件可以对产物进行定性和定量分析，计算待测样品模板的初始浓度。在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。

荧光定量PCR仪适用于基于能够在PCR产物生成过程中对产物进行标记荧光的反应，例如TaqMan、分子信标、SYBR Green、MGB等荧光化学体系。

1、样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。

2、域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。

3、如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。

7500 Fast型实时PCR系统，可在最短的时间内为从事不同应用的实验室提供最佳的实验性能，同时还可以进行高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）分析。

1.开始运行仪器

打开电脑，打开定量PCR仪底座开关启动CFX Manager软件。

2.放置样品

将PCR反应体系加入到0.2ml低缘八联管，盖上管盖；或加入低缘96孔板，用光学级封膜封好。注意，必须带一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。

3.设置程序，运行实验

定量PCR软件操作基本步骤为：

a.设置热循环程序文件（Protocol Tab），点击Edit（编辑）或Create New（创建新程序）。

b.设置反应板文件（Plate Tab），选择本次实验所要使用的荧光染料种类；单击样品类型；如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（Standard），点击“Dilution Series”键可设置其标准品浓度及稀释倍数。。

c.点击“Start Run”键，单击open lid（打开热盖）或Close lid（关闭热盖）放置样品；单击Start Run，保存文件，开始运行程序。

4.结果分析

PCR反应结束后，软件会自动计算标准曲线和Ct值等。如需进行表达量分析、等位基因分析等，在软件窗口选择相应分析功能。点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告单。

5.关闭运行仪器

实验结束后取出反应管，顺序关闭CFX Manager软件、定量PCR仪电源，关闭电脑。

1、实验室注意分区：试剂准备间，样本处理间，PCR室，电泳间要有明确区分，各房间实验室的实验服不得混用。

2、试剂准备间及样本处理间不处理实验相关的高浓度的核酸模板（如高浓度的标准品，PCR产物，miRNA的minics等）。

3、减少频繁多次的走动，尤其去过电泳间之后当天不可进入其他房间。

4、使用生物安全柜加样，不同位置的移液器不可混用，不要随意更换其位置。

5、在检测体系中添加UNG酶系统用于避免PCR产物的污染。