血小板的减少与肝硬化肝功能损害、脾功能亢进、免疫异常等有关,但乙型肝炎肝硬化不同病毒载量对血小板的影响,尤其对骨髓巨核细胞的影响,国内外鲜见报道。本实验采用体外培养MK,将不同病毒载量的乙型肝炎肝硬化患者血清加人培养体系中,检测乙型肝炎肝硬化患者血清对体外培养MK增殖及分化的影响。

一、资料与方法
1.研究对象:根据血生物化学、腹部彩色多普勒超声、胃镜检查确诊的乙型肝炎肝硬化患者10例,其中HBV病毒载量(1.0~⒐9)×10的3次方拷贝/ml者6例,(1.0~⒐9)×10的6次方拷贝/ml者4例,正常对照6例均为本科室志愿者,HBVDNA未检测到。清晨空腹采血10ml,人无菌离心管,2500r/min离心15min,-20℃保存。

2.实验材料及仪器:人MK白血病细胞株Dami购自上海信然生物科技有限公司;DMSO购自北京索莱宝公司;PMPI1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司;细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒CCK8购自武汉博士德生物科技有限公司;·血小板生成素购自美国PEPROTECH公司;二氧化碳孵育箱购自美国Them公司;双目倒置显微镜购自日本Nikon公司;倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司;酶标仪购自郑州安图生物科技有限公司。

3.细胞培养:培养细胞为人MK白血病细胞株Dami,调整细胞浓度为1×10的6次方个/ml,置于乃25cm2培养瓶中,加人含10%胎牛血清的培养基6~7ml,置于37℃,5%二氧化碳孵育箱中培养,2~3d传代一次,取对数期细胞进行各项试验,每组内每例各设3个复孔。

4.CCK-8检测细胞增殖抑制:CCK-8,是一种基于2-(2-甲氧基-4-硝基苯酚)-3-（4-硝基苯酚)（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒,在电子载体的作用下被细胞线粒体中的一些脱氢酶还原变为橙黄色。细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。因而检测CCK-8吸光度值与巨核细胞集落形成数测定可反映巨核细胞增殖情况。收集对数期细胞,接种至96孔板,每孔加入200ul细胞悬液,铺板使待测细胞密度调至10的3次方~10的4次方个/孔,5%二氧化碳,37℃孵育24h至细胞单层铺满孔底。设立正常对照组,HBV为10的6次方拷贝/ml组;HBV为10的3次方拷贝/ml组,并同时设置调零孔(培养基、CCK-8),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、CCK-8,每孔除加RMPI1640培养液180ul外,正常对照组加正常人血清20ul,10的3次方拷贝/ml组、10的6次方拷贝/ml组各加人相应血清20ul5%二氧化碳,37℃孵育48h,倒置显微镜下观察,每孔加人20ulCCK-8溶液,分别于30min,1、2、3、4h使用酶标仪在笱450nm波长处检测每孔的吸光度值。

5.甲基纤维素法培养骨髓MK集落:培养体系为:10%的β巯基乙醇,40%体积分数为0.9%的甲基纤维素,30%的胎牛血清,10%的10ng/ml促血小板生成素及10ng/ml的GM-CSF,1%细胞悬液,总量为1ml接种至24孔板中,将培养基置于37℃,湿度100%,5%二氧化碳培养箱中培养12d后,细胞用95%乙醇固定,用乙酰胆碱酯酶染色法和苏木素复染鉴定骨髓MK集落,显微镜下计数骨髓NIK集落。集落标准为大于或等于3个MK。

6,流式检测骨髓MKCD41的表达:取对数期细胞,按1×10的6次方个/ml接种于6孔板内,每孔2ml,37℃,5%二氧化碳培养箱中孵育24h,使细胞均一化。分为3组,分别为正常对照组,HBVDNA为10的3次方拷贝/ml组,HBVDNA为10的6次方拷贝/ml组。每组分别用不含血清的1640培养液培养,依次加人正常人血清,病毒载量为10的3次方拷贝/ml的患者血清,病毒载量为10的6次方拷贝/ml的患者血清各200ul,TPO50ng/ml,每周两次半量换液。培养10d后应用流式检测CD41的表达。

7,统计学方法:采用SPSS13.0统计软件处理数据,计数资料以均数±标准差表示,首先进行正态性检验和方差齐性检验;满足单因素方差分析条件进行单因素方差分析,然后进行MultipleComparisonsLDS两组之间分析,比较两组之间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.细胞增殖抑制的检测:10的3次方拷贝/ml组、10的6次方拷贝/ml组的CCK-8闷吸光度值分别为0.267±0.156、0.246±0.179,明显低于正常对照组的0.402±0.168,两组比较,F=5.029,P<0.05,差异有统计学意义;10的3次方拷贝/ml组、10的6次方拷贝/ml组的MK的集落数明显减低,分别为31.5±3.0、27.4±3.1,与正常对照组的49.0±3.4比较,F=132.142,P<0.05,差异有统计学意义,表明不同浓度乙型肝炎病毒载量影响体外MK增殖。

2．流式细胞仪检测MKCD41表达:10的3次方拷贝/ml组、10的6次方拷贝/ml组MK明显增加,CD41阳性率分别为57.78%±19.53%、79.90%±16.90%,与正常对照组的36.46%±20.94%比较,t值分别为3.865、2.191,P均<0.05。差异有统计学意义;10的3次方拷贝/ml组和正常对照组明显高于同型对照组的1.16%±0.36%,t值分别为3.865、2.191,P均<0.05,差异有统计学意义;10的3次方拷贝/ml组CD41表达低于10的6次方拷贝/ml组,t=2.273,P<0.05,差异有统计学意义,表明不同浓度乙型肝炎病毒载量影响体外MK分化。

三、讨论

外周血血 小板是由骨髓中的MK增殖分化而来,在增殖过程中MK按原始、幼稚、颗粒、产血小板MK顺序逐渐成熟,最终脱去血小板变成裸核而消失。骨髓MK生成血小板 是一个复杂的生物学过程,包括造血干细胞发育为巨核祖细胞,又进一步分化为成、熟的MK,并释出血小板。Dami血细胞是人MK白血病细胞株,具有很多骨 髓MK的形态和生物学方面的特征,当被诱导分化时,优先分化成MK。与其他MK株相比,Dami细胞表达WIK具有的表面标志物,如血小板表面糖蛋白复合 物、血小板表面糖蛋白Ib(GPIb)、血小板表面糖蛋白A等,并且表面表达有TPO受体c-Mpl,能够被诱导增殖和分化而产生c-Mpl板。由于目前 获得正常人骨髓MK较为困难,且尚缺乏体外培养正常人骨髓NIK的成熟技术,因此Dami是体外研究MK生长发育及其调控的较理想模型。

肝硬化时 普遍存在外周血小板减少,但血小板减少原因目前尚不十分清楚。既往认为肝硬化患者由于脾大及脾功能亢进,脾脏病理性肿大阻留、吞噬血小板,导致血小板减 少。也有人认为慢性活动性乙型肝炎伴自身免疫功能紊乱,血小板相关免疫球蛋白水平升高,使血小板免疫破坏增加,致血小板减少。自从发现TPO以来,越来越 多的研究表明,肝硬化患者血小板减少可能与肝硬化TPO降低有关,TPO降低导致MK分化、成熟障碍,从而影响血小板生成。Pradella等检测肝硬化 患者血清TPO、网织血小板、糖盏蛋白,结果表明肝硬化患者较正常人血清TPO水平明显下降,网织血小板绝对值降低,糖盏蛋白明显增加,提出肝硬化患者血 小板降低与血小板清除增加、生成减少有关。而Sanjo等研究结果显示肝硬化患者血清TPO水平较正常对照组显著升高。Kajihara等则发现在肝硬化 患者和健康人之间,TPO水平并没有差别,认为πV的缺乏并不是引起肝硬化血小板减少症的主要因素。因此推测乙型肝炎肝硬化血小板减少的主要原因,除 TPO外可能还有其他原因参与。

乙型肝炎 肝硬化患者体内存在乙型肝炎病毒,有研究表明,乙型肝炎病毒可改变造血微环境,尤其是对骨髓基质细胞的影响,而骨髓基质细胞是骨髓HSC/祖细胞生长发育 的重要微环境,其对造血调控起着非常重要的作用。基质细胞通过与HsC/IIPC接触和分泌多种细胞因子如干细胞生长因子、TPO、白细胞介素6(IL- 6)和IL-11等重要造血细胞因子,调控HSC/HPC的增殖、分化,维持骨髓正常造血。当机体感染HBV后,病毒可通过对骨髓基质细胞影响、干扰机体 造血机能。但对于肝硬化患者不同病毒载量是否影响MK增殖、分化,目前国内外鲜见报道。

本实验 10的3次方拷贝/ml组、10的6次方拷贝/ml组CCK-8的吸光度值和MK集落生成数均明显低于正常对照组,且10的3次方拷贝/ml组MK集落生 成数高于10的6次方拷贝/ml组,表明不同浓度乙型肝炎病毒载量影响体外MK增殖,病毒载量越大,其对骨髓MK增殖抑制作用越大。

CD41 既是GPⅡb/Ⅲa复合物的单克隆抗体又是GPⅡb的单克隆抗体,其是MK合成的与血小板聚集功能相关的糖蛋白,是特异性分化抗原,可持续表达到血小板, 且含量随MK的分化成熟而不断增加,生理状况下随着MKDNA倍体的增加而表达增高。测定CD41的活性能可靠地获知血小板GPⅡb/Ⅲa复合物的活性, 因此可通过检测MKCD41的表达来检测MK分化程度。本实验10的3次方拷贝/ml组、10的6次方拷贝/ml组MKCD41表达明显增加,与正常对照 组相比,差异有统计学(P<0.05),10的3次方拷贝/ml组CD41表达低于10的6次方拷贝/ml组,差异有统计学意义 (P<0.05),表明不同浓度乙型肝炎病毒载量影响体外MK分化。

因此推测,乙型肝炎肝硬化患者在抗病毒治疗后,有可能减轻乙型肝炎病毒对骨髓MK增殖、分化的影响,增加外周血小板量,减轻低血小板血症。