乙型肝炎病毒 (hepatitisBvirus,HBV)有4个开放读码框架，编码6种蛋白，其中的S基因编码3种外膜蛋白，包括主蛋白(即HBsAg)，中蛋白(即 HBsAg和Pre-S2蛋白)和大蛋白(即HBsAg,Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白)。随着人们对乙肝病毒认识的深人，在预防、诊断和治疗方面 都有了一定的突破，既往的常规诊断方法(包括乙肝标志物、乙肝核酸的检测)已不能满足临床诊治需求。近年来通过对乙肝病毒外膜大蛋白 (hepatitisBviruslargesurfaceprotein,HBV-LP)在乙型肝炎发病机制、感染与病毒复制等方面的探究，逐渐认识到 其具有较为重要的临床意义。血清HBV-LP为临床提供了一个新的监测HBV感染者体内病毒复制、疾病进程、抗病毒疗效、肝细胞损伤与预后的血清学敏感指 标，尤其适用于血清HBeAg阴性和低水平HBVDNA复制的HBV感染者的监测，能弥补HBVDNA监测的不足，有助于提高HBV感染者的血清学诊断的 准确性，对指导临床乙肝的治疗具有一定的应用价值。 我们在既往的研究中，获得了HBV-LP的单抗和多抗。因此我们力图建立HBV-LP的ELISA检测方法。

         对象与方法

        1.1仪器深圳汇松科技发展有限公司生产的PW-960型洗板机，美国Thermo公司生产的LabsystemsMK3型酶标仪。

        1.2 试剂96孔酶标板购自北京凤翔科技有限公司，辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)、四甲基联苯胺 (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB)购自美国Sigma公司，其他常规化学试剂购自北京化学试剂公司。HBV- LP及其多抗和单抗为本室保存。

        1.3方法
          1.3.1HBV-LP单抗的标记:根据参考文献〔4]，应用改良过碘酸盐氧化法，用HRP对HBV-LP单抗进行标记。

          1.3.2检测方法的建立:应用双抗体夹心法，将纯化的多抗按常规方法，以碳酸盐缓冲液做不同浓度稀释，包被ELISA板，4℃过夜，取出后洗板3次，再 用1%BSA于37℃封闭2h后洗涤。用阴、阳性血清作方阵滴定，于37℃放置1h后洗板，每孔中加人100闪稀释至工作浓度的酶标HBV-LP单 抗，370C1h后洗板，再向每孔中加人100闪TMB显色液，37℃反应10min，最后加人2mol/L的HZSO:终止反应，用酶联检测仪测定 A45。值，进行结果判定。反应条件及反应液配制，根据参考文献介绍方法进行调整优化而来。

          1.3.3HBV-LPELISA检测方法的性能评估:按参考文献「5〕所述方法，对检测系统的特异性、精密度、稳定性评估。

       1.4统计学方法应用SPSS13.0软件进行数据的统计分析2结果
       2.1HBV-LPELISA各种工作液和反应条件的确立

          2.1.1包被液及封闭液:选取了1份强阳性和1份弱阳性血清，对不同的包被液和封闭液，进行了比较，见表1。结果显示选择碳酸盐包被液和牛血清白蛋白 (BSA)封闭液时，所获得的人/w值较好。因此，选用碳酸盐包被液和BSA封闭液，用于固相抗体的包被及封闭。

          2.1.2抗体包被血清稀释倍数的选择:采用倍比稀释的方法，对包被多抗和已知阴、阳性血清进行系列稀释后，通过方阵滴定试验，确定最佳稀释倍数，检测结 果见表2。在血清及包被抗原的稀释倍数较低时，阳性血清的A值维持在一个较高水平，随着稀释倍数的增加，A值呈下降趋势。酶标仪在A值为1.0左右时误差最小，反应最灵敏。通过表2数据我们可以看出，当多抗包被浓度为25一100}a,g/ml,血清最佳稀释倍数为1:80满足上述条件。考虑到节省包被抗体，最终确定抗体包被最佳浓度为25N.,g/ml，血清稀释倍数为1:80。

          2.1.3酶标抗体的稀释度:酶标抗体进行系列稀释后，分别对强阳性和弱阳性血清进行检测，计算Asiw，结果显示1:2000时结果最好。

         2.1.4判断标准的计算:取40份阴性血清用初步建立的ELISA方法进行检测，以40份阴性血清的平均A值加3倍标准方差作为阴阳性的临界值，计算结果为0.252，大于此值为阳性，小于或等于此值为阴性。